Особенности преаналитического этапа при выполнении общего клинического анализа крови на автоматических гематологических анализаторах.

Общий клинический анализ крови – наиболее часто выполняемое исследование в КДЛ. Как правило, в лабораториях аналитический этап данного исследования полностью автоматизирован, поэтому процент ошибок на том этапе минимален. А вот преаналитический этап требует самого пристального внимания. Какие факторы преаналитического этапа могут серьезно повлиять на качество результатов и как их избежать, мы постарались изложить в данном методическом материале. Надеемся, он будет полезным в вашей работе.

Информация о наполнителях и особенности преаналитического этапа при гематологических исследованиях

Для выполнения общего клинического анализа крови в основном используют вакуумные пробирки, содержащие двукалиевую (К₂ЭДТА) и трикалиевую (К₃ЭДТА) соли ЭДТА.

ЭДТА надежно блокирует процессы свертывания крови, связывая ионизированный кальций и при этом, в отличие от других антикоагулянтов (в частности, гепарина лития или цитрата натрия) не вызывает структурных изменений клеточных элементов.

Поскольку, для выполнения исследования образца крови в гематологии требуются совсем небольшие объемы крови (в частности, для выполнения автоматизированного анализа крови необходимо всего от 10 до 300 мкл),  рационально применение вакуумных пробирок для взятия венозной крови с объемом не более 2-3 мл и размером 13x75 мм.

Концентрация ЭДТА в пробе крови

Концентрации К₂ЭДТА и К₃ЭДТА в образце взятой крови должна составлять от 4,1 до 6,8 ммоль/л крови (от 1,2 до 2,0 мг/мл крови).

Для выполнения этого требования, во-первых, надо использовать пробирки надлежащего качества, во-вторых, необходимо строго соблюдать объем взятой крови, который должен соответствовать указанной на пробирке отметке. Пробирку следует извлекать из держателя только после того, как пробирка наполнилась и кровь прекратила в нее поступать. В обязательном порядке необходимо проверить соответствие уровня заполнения пробирки метке номинального объема. Допустимо не более 10% отклонения от объема наполнения пробирки (например, при общем объеме заполнения пробирки 5 мл отклонение в объеме может составить 0,5 мл).

Недостаток антикоагулянта приводит к свертыванию крови и образованию микросгустков, что может являться причиной занижения количества клеток при автоматическом подсчете, а также засорения магистралей гематологического анализатора и нарушению работы прибора.

Избыточная концентрация антикоагулянта, обусловленная недостаточным заполнением пробирки, как правило, ведет к сморщиванию эритроцитов вследствие повышения осмотического давления и искажению таких клинических показателей, как гематокрит (HCT), средний объем эритроцитов (MCV), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (MCH)  и т.д.

ВАЖНО! Для того, чтобы все молекулы Са²⁺, содержащиеся в пробе крови были оперативно связны, необходимо обеспечить максимально полное взаимодействие К₂ЭДТА (К₃ЭДТА) с пробой крови. Поэтому сразу после взятия крови в вакуумную пробирку с ЭДТА ее необходимо тщательно перемешать, плавно переворачивая 8–10 раз. Последствия недостаточно тщательного перемешивания проб крови с антикоагулянтом всегда необратимы. Пробы вследствие образования сгустка не подлежат исследованию. А микросгустки, которые не видны невооруженным глазом, как уже было сказано выше - причина недостоверных результатов анализа и риск выхода из строя автоанализатора.

Выполнение анализа крови на гематологическом анализаторе. Что обязательно следует учитывать?

Время выполнения гематологического исследования после взятия крови

Недостаточно тщательное перемешивание крови перед выполнением исследования цельной крови на гематологическом анализаторе является одним из наиболее серьезных источников погрешности! Дело в том, что после того, как цельную кровь, забранную в пробирку с антикоагулянтом, ставят в штатив, начинается неумолимый отсчет времени и запускается процесс седиментации клеток. Это явление всем очень хорошо известно, так как на нем основано определение СОЭ. Уже в первые минуты стояния образца крови эритроциты продолжают беспорядочно перемещаться и агрегируют. Практически мгновенно они формируют «монетные столбики» (Рис. 1 и Рис. 2).

Рисунок 1.  Агрегация эритроцитов.  Электронная микрофотография  «монетных столбиков» (сканирующий микроскоп).

Рисунок 2.  Агрегация эритроцитов.  В формировании молекулярных связей между поверхностью отдельных эритроцитов участвуют фибриноген и глобулины. 

Эритроцитарные агрегаты вначале имеют небольшие размеры - спустя 4 мин после того, как кровь поместили в пробирку, состоят примерно из 10‑ти эритроцитов. Далее они постепенно становятся крупнее и разветвляются. Число эритроцитов в таких агрегатах достигает пятидесяти и более. Удельный вес агрегатов эритроцитов достаточно большой, поэтому они  перемещаются в нижнюю часть пробирки, вытесняя значительно более легкие лейкоциты и тромбоциты в верхнюю часть пробы.  Таким образом, при хранении пробирок с несвернувшейся кровью в вертикальном положении лейкоциты и тромбоциты скапливаются в виде белого слоя на границе раздела между осевшими эритроцитами и плазмой, образуя так называемую, лейкоцитарно-тромбоцитарную пленку.

Каждый сотрудник КДЛ, работающий с цельной кровью, знает, насколько непросто выполнить качественное перемешивание образца после того, как пробирка с кровью постояла более получаса. Резко встряхивать пробирку категорически нельзя, поскольку это приведет к гемолизу части эритроцитов! А поскольку плавные движения, из-за высокой вязкости цельной крови – не очень эффективны, чтобы качественно перемешать кровь, требуется медленно переворачивать пробирку не менее 8–10 раз! При большом количестве проб это достаточно трудоемко, поэтому лучше для этих целей использовать специализированный гематологический миксер.

Насколько серьезно на результат автоматического анализа может повлиять эффект седиментации клеток при недостаточном перемешивании пробы крови продемонстрируем на практических примерах. Исследования проводились на базе ООО «Эйлитон» с использованием вакуумных пробирок UNIVAC^® с К₂ЭДТА (13 х 75, объем 5 мл).

На первом этапе провели пятикратное измерение образца венозной крови пациента на автоматическом гематологическом анализаторе непосредственно после венепункции. После взятия крови содержимое пробирки тщательно перемешали, плавно переворачивая пробирку 8–10 раз. Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты измерения гематологических показателей на гематологическом анализаторе непосредственно после взятия крови.

^*SD - среднее квадратическое отклонение, ^**CV - коэффициент вариации, ^***В - границы достоверности, рассчитанные по формуле: B = X ±1.96SD.

Как видно из таблицы, при качественном перемешивании пробы после взятия крови и перед выполнением исследования результаты автоматического анализа высоко воспроизводимы.

Для моделирования эффекта седиментации по 400 мкл крови переносили в 8 микропробирок. Микропробирки помещали в штатив и хранили при комнатной температуре. Через определенные интервалы времени (1, 5, 10 и 20 минут) забирали по 2 пробирки для измерения основных гематологических показателей. Забор крови осуществляли со дна микропробирки (Рисунок 3), т.к. в верхней части очень быстро происходило расслаивание и результаты измерения в большей степени определялись положением иглы пробоотборника, поэтому были невоспроизводимыми.

Рисунок 3. Положение иглы пробозаборника гематологического анализатора при исследовании эффекта седиментации.

Полученные результаты представлены в Таблице 2 и на Рисунках 4, 5. 

Таблица 2. Влияние эффекта седиментации форменных элементов на результаты анализа.

Рисунок 4. Влияние эффекта седиментации на результаты автоматического определения концентрации эритроцитов и лейкоцитов.

Таблица 3. Исследование эффекта предотвращения седиментации форменных элементов крови с использованием гематологического миксера.